【柏恒科技小課堂】超微量分光光度計你了解多少！

超微量分光光度計是一種用于測量微量樣品吸光度的儀器，通常用于核酸和蛋白質的濃度測量。

主要特點：

1.能夠測量微量樣品的吸光度，通常在納升至微升級別。

2.高靈敏度和精確度，能夠準確測量核酸和蛋白質的濃度。

3.通常采用紫外-可見分光光度法進行測量。

4.一般具有緊湊的設計和易操作的特點。

工作原理：

核酸和蛋白質在紫外-可見光波長范圍內具有特定的吸光特性。

通過將樣品放置在光路中，利用光源照射樣品，測量樣品在特定波長下透射或反射的光強，即吸光度。根據樣品在特定波長下的吸光度值，結合已知的標準曲線或專門的軟件，可以計算出核酸或蛋白質的濃度。

超微量分光度計是一種常用的測定DNA和RNA濃度的方法。

通過測量特定波長下的光密度（OD值），可以間接計算出核酸的濃度。

以下是該方法的基本原理和操作步驟：

OD值的含義

OD是optical density的縮寫，表示被檢測物質吸收的光密度。由于核酸中的堿基具有共雙鍵結構，因此它們具有紫外光吸收特性。

不同波長的吸收峰

OD260：DNA雙鏈的吸收峰，主要反映DNA的濃度。
OD280：芳香族氨基酸的吸收峰，主要用于判斷蛋白質污染程度。
OD230：核酸提取過程中使用的鹽離子在230nm處有吸收峰，如果OD230很高，說明鹽離子濃度較高。

純度判斷

OD260/OD280的比值用于判斷RNA或DNA的純度。高純度的DNA比值應該在1.8-2.0之間。

如果比值低于1.8，說明蛋白質污染較嚴重；高于2.0，則說明可能有RNA污染。

操作步驟

準備核酸樣品：將待測的DNA或RNA樣品溶解在適當濃度的緩沖液中。
測量OD值：使用產微量分光光度計，分別測量260nm、280nm和230nm處的光密度。
計算濃度：根據已知的摩爾消光系數，計算DNA或RNA的濃度。

注意事項 
實驗過程中要避免蛋白質和鹽離子的污染，否則會影響結果的準確性。
測量時要保持樣品池和空白池的清潔，避免雜質干擾。

常見的用途

無論在物理學、化學、生物學、醫學、材料學、環境科學等科學研究領域 ,還是在化工、醫藥、環境檢測、冶金等現代生產與管理部門 ,紫外可見分光光度計督有廣泛而重要的應用。分光光度計就是利用分光光度法對物質進行定量定性分析的儀器，常用于核酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。

超微量分光光度計已成為現代分子生物實驗室常規儀器。

常用于核酸，蛋白定量以及細菌生長濃度的定量。

核酸的定量

核酸的定量是超微量分光光度計使用頻率最高的功能。可以定量溶于緩沖液的寡核苷酸，單鏈、雙鏈DNA，以及RNA。

核酸的最高吸收峰的吸收波長260 nm。每種核酸的分子構成不一，因此其換算系數不同。定量不同類型的核酸，事先要選擇對應的系數。

如：1OD 的吸光值分別相當于50μg/ml的dsDNA，37μg/ml的ssDNA，40μg/ml的RNA，30μg/ml的Olig。測試后的吸光值經過上述系數的換算，從而得出相應的樣品濃度。

測試前，選擇正確的程序，輸入原液和稀釋液的體積，爾后測試空白液和樣品液。然而，實驗并非一帆風順。

讀數不穩定可能是實驗者最頭痛的問題。靈敏度越高的儀器，表現出的吸光值漂移越大。

除了核酸濃度，分光光度計同時顯示幾個非常重要的比值表示樣品的純度，如A260/A280的比值，用于評估樣品的純度，因為蛋白的吸收峰是280nm。

純凈的樣品，比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，表示存在蛋白質或者~~物質的影響。A230表示樣品中存在一些污染物，如碳水化合物，多肽等，較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。

A320檢測溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品，A320一般是0。

蛋白質直接定量

是在280nm波長，直接測試蛋白。選擇Warburg 公式，光度計可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應的換算方法，將吸光值轉換為樣品濃度。

蛋白質測定過程非常簡單，先測試空白液，然后直接測試蛋白質。由于緩沖液中存在一些雜質，一般要消除320nm 的“背景"信息，設定此功能“開"。與測試核酸類似，要求A280的吸光值至少大于0.1A，最佳的線性范圍在1.0-1.5 之間。

實驗中選擇Warburg 公式顯示樣品濃度時，發現讀數“漂移"。這是一個正常的現象。事實上，只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過1%，表明結果非常穩定。漂移的原因是因為Warburg 公式吸光值換算成濃度，乘以一定的系數，只要吸光值有少許改變，濃度就會被放大，從而顯得結果很不穩定。

蛋白質直接定量方法，適合測試較純凈、成分相對單一的蛋白質。紫外直接定量法相對于比色法來說，速度快，操作簡單；但是容易受到平行物質的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。

OD 600

實驗室確定細菌生長密度和生長期，多根據經驗和目測推斷細菌的生長密度。在遇到要求較高的實驗，需要采用分光光度計準確測定細菌細胞密度。

OD600是追蹤液體培養物中微生物生長的標準方法。以未加菌液的培養液作為空白液，之后定量培養后的含菌培養液。為了保證正確操作，必須針對每種微生物和每臺儀器用顯微鏡進行細胞計數，做出校正曲線。實驗中偶爾會出現菌液的OD值出現負值，原因是采用了顯色的培養基，即細菌培養一段時間后，與培養基反應，發生變色反應。

另外，需注意的是，測試的樣品不能離心，保持細菌懸浮狀態。