【qPCR】熒光定量PCR的熔解曲線，你了解多少？

熔解曲線探針法的原理

在實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)雙鏈DNA受熱時(shí)，其互補(bǔ)堿基之間的氫鍵逐漸斷裂，導(dǎo)致雙鏈分離成兩條單鏈，這一過程被稱為DNA的“熔解"。隨著溫度的升高，DNA的熒光強(qiáng)度會(huì)發(fā)生變化，通過監(jiān)測這種變化，可以繪制出DNA的熔解曲線。探針法熔解曲線分析利用特異性探針結(jié)合到目標(biāo)DNA序列上，通過對(duì)探針與目標(biāo)DNA結(jié)合狀態(tài)的溫度依賴性檢測，來識(shí)別和定量特定的DNA或RNA序列。

探針設(shè)計(jì)：設(shè)計(jì)特異性探針，確保其與目標(biāo)序列匹配。

PCR擴(kuò)增：將探針、引物、模板DNA和熒光染料加入反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

熔解曲線分析：PCR完成后，逐步升溫，實(shí)時(shí)監(jiān)測熒光信號(hào)的變化。

數(shù)據(jù)分析：根據(jù)熔解曲線的峰值（Tm值）判斷目標(biāo)序列的特性。

特異性高：探針法熔解曲線分析利用特異性探針結(jié)合到目標(biāo)DNA序列上，通過監(jiān)測探針與目標(biāo)DNA結(jié)合狀態(tài)的溫度依賴性變化，能夠精確識(shí)別和定量特定的DNA或RNA序列。當(dāng)探針與目標(biāo)序列匹配時(shí)，熔解溫度（Tm值）較高；如果存在單核苷酸多態(tài)性（SNPs）或其他變異，Tm值會(huì)下降，從而可以精確識(shí)別序列差異。

靈敏度高：探針法熔解曲線技術(shù)能夠檢測到非常低的DNA濃度變化，適用于微量樣本的檢測。通過監(jiān)測熒光信號(hào)的變化，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)序列的靈敏檢測。

操作簡便：相比其他分子生物學(xué)技術(shù)，探針法熔解曲線技術(shù)的操作相對(duì)簡便。實(shí)驗(yàn)者只需在PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行DNA雙鏈產(chǎn)物升溫解鏈反應(yīng)，監(jiān)測熒光信號(hào)的變化即可繪制出熔解曲線。

應(yīng)用廣泛：該技術(shù)廣泛應(yīng)用于基因分型、SNP檢測、病原體鑒定等領(lǐng)域。通過比較不同樣本的熔解曲線，可以精確地識(shí)別出序列差異，為遺傳學(xué)研究和臨床診斷提供重要依據(jù)。

峰型倒置現(xiàn)象：在探針法熔解曲線中，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)峰型倒置現(xiàn)象，即在某個(gè)溫度點(diǎn)后熒光信號(hào)反而增強(qiáng)。這種現(xiàn)象可能是由于探針解離動(dòng)力學(xué)、非特異性產(chǎn)物、引物二聚體、探針設(shè)計(jì)問題或熒光染料特性等因素引起的。雖然這種現(xiàn)象可能指示實(shí)驗(yàn)中的非特異性事件，但也可以通過合理設(shè)計(jì)和優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件來避免或解釋這種現(xiàn)象。

突變檢測：識(shí)別點(diǎn)突變、基因重排等。

病原體鑒定：快速檢測病毒、細(xì)菌等病原體的特異性序列。

腫瘤標(biāo)志物檢測：用于腫瘤相關(guān)基因突變的篩查。

藥物基因組學(xué)：研究藥物代謝相關(guān)基因的多態(tài)性。