實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀使用的基本步驟

　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀技術(shù)的原理：體外核酸擴(kuò)增，加熱使雙鏈DNA解開螺旋，在退火溫度條件下引物同模板DNA雜交，在Taq DNA聚合酶，dNTPs（脫氧核糖核苷三磷酸），Mg2+和合適pH緩沖液存在條件下延伸引物，重復(fù)“變性→退火一引物延伸”過程至25-40個(gè)循環(huán)，呈指數(shù)級(jí)擴(kuò)大待測(cè)樣本中的核酸拷貝數(shù)。簡(jiǎn)單的說，PCR儀就是利用DNA聚合酶對(duì)特定基因做體外或試管內(nèi)的大量合成，基本上它是利用DNA聚合酶進(jìn)行專一性的連鎖復(fù)制。目前常用的技術(shù)，可以將一段基因復(fù)制為原來(lái)的一百億至一千億倍。

　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀使用的基本步驟：

　　①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93℃（左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；

　　②模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；

　　③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。

　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2~4分鐘，2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。到達(dá)平臺(tái)期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。反應(yīng)初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產(chǎn)物的逐漸積累，進(jìn)入線性增長(zhǎng)期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)”，這種效應(yīng)稱平臺(tái)期數(shù)、PCR擴(kuò)增效率及DNA聚合酶PCR的種類和活性及非特異性產(chǎn)物的競(jìng)爭(zhēng)等因素。大多數(shù)情況下，平臺(tái)期的到來(lái)是不可避免的。