細(xì)胞凍存盒的實(shí)驗(yàn)步驟，您都知道嗎？

　　什么是細(xì)胞凍存？

　　細(xì)胞長(zhǎng)勢(shì)良好，供大于求時(shí)，就可以考慮把細(xì)胞凍存起來，以后再用。當(dāng)溫度低于-70℃時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的酶活性全部停止，代謝活動(dòng)停止，故可以達(dá)到長(zhǎng)期保存的目的。隨著溫度降低，細(xì)胞內(nèi)外的水分都會(huì)結(jié)晶，所形成的冰晶會(huì)造成細(xì)胞膜和細(xì)胞器的破壞，從而引起細(xì)胞死亡，特別是-20-0℃的階段，冰晶呈針狀，及容易引發(fā)細(xì)胞損傷。

　　細(xì)胞凍存盒的基本原則是緩慢冷凍，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以大限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。

　　細(xì)胞凍存盒的實(shí)驗(yàn)步驟：

　　1.配制含10%DMSO、20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液4mL。

　　2.取出生長(zhǎng)良好的細(xì)胞。

　　3.吸除舊的培養(yǎng)液：拿出吸管（要拿吸管的上端），插入與抽濾瓶相連的橡膠管中，在酒精燈外焰灼燒滅菌，細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)A斜將吸管插入瓶底部一角，吸出舊的培養(yǎng)液，將用后的吸管棄于廢棄缸里。

　　4.消化：拿出5mL移液管，插入電槍中，酒精燈過火灼燒，吸取2mL0.25%胰酶，混勻，放于37℃孵箱中消化5-6min。取下用后的移液管。

　　5.中和：從孵箱中拿出培養(yǎng)瓶，顯微鏡下觀察細(xì)胞是否被*消化下來，5mL滅菌后移液管加入3mL培養(yǎng)液終止消化。

　　6.離心收集細(xì)胞：配平后離心200×g，3min。將新培養(yǎng)液加入新培養(yǎng)瓶中，2mL／瓶（培養(yǎng)瓶底面積為25cm2）。

　　7.分裝凍存：將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管1mL。

　　8.在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時(shí)間及操作者；

　　9.凍存：細(xì)胞凍存盒，里面有異丙醇，直接放入-80過夜，凍存盒自動(dòng)緩慢降溫。然后-196℃液氮保存。