詳解非洲豬瘟PCR儀檢測方法

　　采集豬的脾臟、淋巴結、血液等組織材料或血粉用于檢測，樣品應在冷藏條件下盡快運輸至實驗室，避免反復凍融。采樣時應穿戴個人生物安全防護裝備，實施現場消毒和廢棄物處理。檢測前樣品應在二級生物安全柜中處理。取0.1g~0.2g組織或血粉，經研磨破碎后加1l的0.01mol/LPBS（pH7.2）制成勻漿，經10000r/min離心取上清；全血、血清樣品直接取1mL，置于1.5皿離心管內蓋緊管帽。將上述處理的樣品置于60℃條件下滅活30min。

　　非洲豬瘟PCR儀病毒DNA提取方式：

　　1、DNA提取應在樣本制備區內采用以下方法進行，若使用其他等效的病毒DNA提取試劑，則按照試劑說明書操作。

　　2、待檢樣品、陽性對照和陰性對照的份數總和用n表示，取n個滅菌1.5l離心管，逐管編號。

　　3、每管加入200uLDNA提取液1，然后分別加入待測樣品、陰性對照和陽性對照各200uL，1份樣品換用1個吸頭，混勻器上震蕩混勻5s。于4℃~25℃條件下，13000r/min離心10min。

　　4、盡可能吸取上清、棄去，吸頭不要碰到沉淀，再加入10uLDNA提取液2，混勻器上震蕩混勻5s。于4℃~25℃條件下，2000r/min離心10s。

　　5、100℃干浴或沸水浴10min。

　　6、加入90uL無DNA酶的滅菌去離子水，13000r/min離心10min，上清即為提取的DNA，-20℃保存備用。

　　非洲豬瘟PCR儀操作步驟：

　　1、在反應混合物配制區、樣品制備區和檢測區分別進行提取。

　　2、每個檢測反應體系需使用20uL實時熒光PCR反應液。充分混勻后分裝，每個PCR反應管20uL。轉移PCR反應管至樣品制備區。

　　3、反應管中分別加入提取的DNA溶液5L，使每管總體積達到25L，記錄反應管對應的樣品編號。蓋緊管蓋后，瞬時離心。

　　4、將加樣后的反應管放入實時熒光PCR檢測儀內，記錄反應管擺放順序。選定5-羧基熒光素（FAM）作為報告基團，小溝結合物（MGB）為淬滅基團，反應參數設置如下：預變性95℃/3 min；95℃/15s，52℃/10s，60℃/35s，45個循環；在每次循環的60℃退火延伸時收集熒光。試驗結束后，根據收集的Ct值和熒光曲線判定結果。

　　非洲豬瘟PCR儀檢測閥值設定原則：閥值線超過陰性對照擴增曲線的高點，且相交于陽性對照擴增曲線進入指數增長期的拐點，或根據儀器噪聲情況進行調整。每個樣品反應管內的熒光信號到達設定的域值時所經歷的循環數即為Ct值。